Cloning and expression of Neospora caninum rhoptry 2 and its potential as an immunobiological for neosporosis control

ABSTRACT: The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.

RESUMO: O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.

Cloning and expression of Neospora caninum rhoptry 2 and its potential as an immunobiological for neosporosis control / Clonagem e expressão de rhoptry 2 Neospora caninum e seu potencial como um imunobiológico para o controle de neosporose

The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.(AU)

O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.(AU)

Antigenic and immunogenic properties of the canine distemper virus nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli employing codon optimized synthetic gene / Propriedades antigênicas e imunogênicas da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina expressa em Escherichia coli empregando gene sintético com codons otimizados

Despite common occurrence and importance of canine distemper disease the majority of tests currently available for diagnosis are hampered by either low sensitivity or specificity. In this study it was evaluated antigenic and immunogenic characteristics of a conserved region of nucleocapsid protein of canine distemper virus (rCDV NP) expressed in Escherichia coli employing a codon optimized synthetic gene. The expression of rCDVNP in Star strain (mean 300μg/mL, purified) was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. Western blot and ELISA, employing positive and negative control dog sera, demonstrated the rCDVNP antigenicity. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was purified from the egg yolk. The mean yield of IgY was 28.55mg/mL. IgY reacted with the recombinant protein as demonstrated by Western blot and ELISA assays. In summary, our findings demonstrated that rCDVNP is antigenic since CDV positive dog sera recognized the protein in vitro. Additionally, the rCDVNP proved to be immunogenic in hens being possible to isolate a high concentration of specific IgY antibodies from the egg yolk. Taken together, these results indicate that the rCDVNP along with the specific IgY could be useful tools for development of the canine distemper immunodiagnostic assays.(AU)

Apesar da ocorrência comum e importância da cinomose canina, a maioria dos testes atualmente disponíveis para diagnóstico são prejudicados pela baixa sensibilidade ou especificidade. Neste estudo foram avaliadas características antigênicas e imunogênicas de uma região conservada da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina (rCDV NP) expressa em Escherichia coli empregando um gene sintético e codons otimizados. A expressão na cepa Star (média de 300μg/mL, purificada) foi confirmada por SDS-PAGE e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-His-Tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por western blot e ELISA empregando soros de cães positivos e negativos. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (gY) foi obtida e purificada a partir da gema. A produção média de IgY foi 28.55mg/mL. Anticorpos IgY reagiram com a proteína recombinante, quando analisados por Western blot e ELISA. Em resumo, nossos achados demonstram que a rCDVNP produzida é antigênica, uma vez que os anticorpos de soro de cães positivos para CDV reconheceram a proteína in vitro. Além disso, a rCDVNP foi imunogênica em galinhas, sendo possível isolar anticorpos IgY específicos a partir da gema do ovo em altas concentrações. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a rCDVNP juntamente com a IgY específica podem ser ferramentas úteis para elaborar ensaios de imunodiagnóstico de cinomose canina.(AU)